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產品簡介
新型布尼亞病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒新型布尼亞病毒，衛生部門從蜱蟲中毒者體內分離出的病毒。或將被認定為一種新型病毒。
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新型布尼亞病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒
產品名稱：新型布尼亞病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒
英文名稱：Novel Bunyavirus Probe qRT-PCR Kit
新型布尼亞病毒，衛生部門從蜱蟲中毒者體內分離出的病毒。或將被認定為一種新型病毒。從目前來看，這一病毒主要由蜱傳播，且可以治療，病死率很低。目前未發現人傳染人的病例。布尼亞病毒自然感染見于許多脊椎動物和節肢動物 (蚊、蜱、白蛉等)，可感染小鼠，并能在一些哺乳類、鳥類和蚊細胞培養中生長; 對人可引起類似流感或登革熱的疾病、出血熱(立夫特谷熱和克里米亞─剛果出血熱等)及腦炎(加利福尼亞腦炎)。有蚊媒、蜱媒、白蛉媒 3 種傳播類型。本產品以探針法熒光定量 RT-PCR 技術為基礎開發的專門檢測新型布尼亞病毒的試劑盒， 它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 RNA 模板。
2. 引物和探針經過優化，靈敏性高。
3. 提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據新型布尼亞病毒高度保守區設計，不會跟其他病毒的
RNA 發生交叉反應。
5. 本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應。
6. 本產品只能用于科研。
【試劑組成】
成分 | 十孔盒包裝 |
探針法 qRT-PCR 緩沖液 | 500 μL（藍蓋） |
探針法 qRT-PCR 酶混合液 | 100 μL（紅蓋） |
熒光PCR 專用模板稀釋液 | 1 mL（黃蓋） |
新型布尼亞病毒探針法 qRT-PCR 引物混合液 | 100 μL（白蓋） |
新型布尼亞病毒 qRT-PCR 探針 | 50 μL（棕色管） |
新型布尼亞病毒探針法 qRT-PCR 陽性對照 (1×10E8 拷貝/μL) | 50 μL（黃蓋） |
使用手冊 | 1 份 |
【運輸及保存】
低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。
【自備試劑】
樣品 RNA。
【注意事項】
一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。
由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原， 本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 RNA 的制備
7. 如果有 N 個樣品，最好設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽
性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用10μL 陽性對照的10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣， 以此作為PC。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒 RNA/提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的柱式病毒 RNAout。
三、Probe qRT-PCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好
后最后加）：
| 成分 | 樣品管N+2個 | RT-PCR陰性對照管 | 標準曲線樣品管（2-7管） |
| 探針法 qRT-PCR 緩沖液 | 各 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
| 探針法 qRT-PCR 酶混合液 | 各 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
| 新型布尼亞病毒 qRT-PCR 探針 | 各 1 μL | 1 μL | 各 1 μL |
新型布尼亞病毒探針法 qRT-PCR引物混合液 | 各 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
| 待測樣品 RNA 模板 | 各 5 μL | - | - |
| 超純水 | 5 μL | - | |
第 7 步所得標準曲線樣品稀釋液（2-7 號） | - | - | 各 5 μL（2號樣到 2 號管，3 號樣到3 號管…） |
11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數進行 qRT-PCR：
過程 | 溫度 | 時間 |
逆轉錄 | 50℃ | 30 min |
預變性 | 94℃ | 10 min |
qRT-PCR 反應 （40 個循環） | 94℃ | 15 sec |
60℃ | 1 min（采集 FAM 通道的熒光信號） |
五、數據處理
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 35，則為陽性。
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