脂肪酸合成酶（FAS）活性試劑盒說明書

                                                         微量法100T/96S

注   意 ：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

FAS是脂肪酸合成關(guān)鍵酶，催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A而生成長鏈脂肪酸。FAS普遍表達(dá)于各種組織細(xì)胞中，在哺乳動物肝、腎、腦、肺和乳腺以及脂肪組織中表達(dá)豐富。

測定原理：

FAS催化乙酰CoA、丙二酰CoA和NADPH生成長鏈脂肪酸和NADP⁺；NADPH在340nm有吸收峰，而NADP⁺沒有；通過測定340nm 光吸收下降速率，計算FAS活性。

自備儀器和用品：

研缽、冰、臺式離心機(jī)、紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體100mL×1瓶，－20℃保存。用前1d取出置于4℃充分解凍后混勻。

試劑二：粉劑×1瓶。臨用前加入440μL試劑四，充分溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入440μL試劑四，充分溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑四：液體20mL×1瓶, 4℃保存。

試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入840μL試劑四，充分溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

粗酶液提取：

1.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。12000g，4℃離心40min，取上清置冰上待測。

2.        細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后12000g，4℃，離心40min，取上清置于冰上待測。

3.        血清等液體：直接測定。

FAS測定操作：

1. 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長到340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑四置于40℃水浴中預(yù)熱30 min。

3. 在96孔板或EP管中依次加入20μL上清液、4μL試劑二、4μL試劑三、164μL試劑四和8μL試劑五，混勻后于340nm處測定吸光值，記錄第30s和90s時吸光值，分別記錄為A1和A2。△A測=A1-A2。

FAS活性計算：

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按照蛋白濃度計算

活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個酶活單位。

FAS(nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反總×10⁹) ÷(Cpr×V樣)÷T

=1608×△A÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：37℃中每克組織每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個酶活單位。

FAS(nmol/min/g 鮮重) = (△A÷ε÷d×V反總×10⁹) ÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=1608×△A ÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計算

活性單位定義：37℃中每10⁴個細(xì)胞每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個酶活單位。

FAS(nmol /min/10⁴cell) = (△A÷ε÷d×V反總×10⁹) ÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

=1608×△A ÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

活性單位定義：37℃中每毫升樣本每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個酶活單位。

FAS(nmol /min/mL) =(△A÷ε÷d×V反總×10⁹) ÷V樣÷T

=1608×△A

ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10^-4L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，1min。

b. 使用96孔板測定的計算公式如下

（1）按照蛋白濃度計算

活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個酶活單位。

FAS(nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反總×10⁹)÷(Cpr×V樣)÷T

=3216×△A÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：37℃中每克組織每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個酶活單位。

FAS(nmol/min/g 鮮重) = (△A÷ε÷d×V反總×10⁹) ÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=3216×△A÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計算

活性單位定義：37℃中每10⁴個細(xì)胞每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個酶活單位。

FAS(nmol /min/10⁴cell) = (△A÷ε÷d×V反總×10⁹)÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

=3216×△A÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

活性單位定義：37℃中每毫升樣本每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個酶活單位。

FAS(nmol /min/mL) =(△A÷ε÷d×V反總×10⁹ )÷V樣÷T

=3216×△A

ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10^-4L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，1min。