氨基酸(amino acid, AA)含量測定試劑盒說明書

                                              微量法 100T/96S

注   意 ：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

動物肝臟、腎臟是氨基酸代謝的主要器官，故尿中氨基酸的變化最能反應肝、腎的生理狀態。另外，氨基酸還能反應灼傷、傷寒等方面情況。植物體內氨基酸含量對研究植物在不同條件下及不同生長發育時期氮代謝變化、植物對氮素的吸收、運輸、同化及營養狀況等有重要意義。

測定原理：

氨基酸的α -氨基可與水合茚三酮反應，產生藍紫色化合物，在570 nm有特征吸收峰；通過測定570 nm吸光度，來計算氨基酸含量。

自備儀器及用品：

臺式離心機、水浴鍋、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、可調式移液槍、研缽、無水乙醇、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶（棕色），4℃避光保存。臨用前加入667μL無水乙醇，蓋緊后充分混勻，再加入9.333 mL蒸餾水混勻，避光保存。

試劑四：粉劑×1管，4℃避光保存。臨用前加1 mL蒸餾水，充分溶解。

標準品：粉劑×1瓶，臨用前加10 mL蒸餾水，充分溶解。1μmol/mL標準液，4℃避光保存。

樣品中AA提取：

1.        按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行室溫勻漿，然后轉移到1.5 mL EP 管中，蓋緊后（防止水分散失）置于沸水浴提取15 min；自來水冷卻后，8000g，，4℃離心10min，上清液置冰上待測。

2.        細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL試劑一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3.        血清等液體：直接檢測。

測定操作：

1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min，調節波長到570 nm，蒸餾水調零。

2. 空白管：取EP管，加入10μL蒸餾水，100μL試劑二，100μL試劑三和10μL試劑四，混勻后蓋緊瓶蓋（防止水分散失），置于沸水浴中保溫15 min，冷卻后反復顛倒EP管數次，于570nm測定吸光值，記為A空白管。顯色后務必在30min內測完。

3. 標準管：取EP管，加入10μL標準品，100μL試劑二，100μL試劑三和10μL試劑四，混勻后蓋緊瓶蓋

（防止水分散失），置于沸水浴中保溫15 min，冷卻后反復顛倒EP管數次，于570nm測定吸光值，記為A標準管。顯色后務必在30min內測完。

4. 測定管：取EP管，加入10μL上清液，100μL試劑二，100μL試劑三和10μL試劑四，混勻后蓋緊瓶蓋（防止水分散失），置于沸水浴中保溫15 min，冷卻后反復顛倒EP管數次，于570nm測定吸光值，記為A測定管。顯色后務必在30min內測完。

注意：空白管和標準管只需要測定一次。

氨基酸含量計算公式：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按蛋白濃度計算

氨基酸含量（μmol /mg prot）= [C標準品×V標準品×(A測定－A空白)÷(A標準－A空白)]÷（V樣×Cpr）

=1×(A測定－A空白)÷(A標準－A空白) ÷Cpr

（2）按樣本質量計算

氨基酸含量（μmol /g 鮮重）=[C標準品×V標準品×(A測定－A空白)÷(A標準－A空白)] ÷（V樣總÷V樣）÷W

=1×(A測定－A空白)÷(A標準－A空白) ÷W

（3）按細胞數量計算

氨基酸含量（μmol /10⁴ cell）=[C標準品×V標準品×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)] ×（V樣總÷V樣×細胞數量）

=1×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管) ÷細胞數量

（4）按照液體體積計算

氨基酸含量（μmol /mL）=[C標準品×V標準品×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)]÷V樣

=1×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)

C標準品：標準品濃度，1 μmol/mL；V標準品：反應體系中加入標準品體積，0.01 mL；W：樣品質量，g；V樣：反應體系中加入樣品提取液體積，0.01 mL；V樣總：樣品提取液總體積，1mL；；Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/mL。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

（1）按蛋白濃度計算

氨基酸含量（μmol /mg prot）=[C標準品×V標準品×(A測定－A空白)÷(A標準－A空白)] ÷（V樣×Cpr）

=1×(A測定－A空白)÷(A標準－A空白) ÷Cpr

（2）按樣本質量計算

氨基酸含量（μmol /g 鮮重）=[C標準品×V標準品×(A測定－A空白)÷(A標準－A空白)]×（V樣總÷V樣）÷W

=1×(A測定－A空白)÷(A標準－A空白) ÷W

（3）按細胞數量計算

氨基酸含量（μmol /10⁴ cell）= [C標準品×V標準品×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)] ×（V樣總÷V樣×細胞數量）

=1×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管) ÷細胞數量

（4）按照液體體積計算

氨基酸含量（μmol /mL）=[C標準品×V標準品×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)]÷V樣

=1×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)

C標準品：標準品濃度，1 μmol/mL；V標準品：反應體系中加入標準品體積，0.01 mL；W：樣品質量，g；V樣：反應體系中加入樣品提取液體積，0.01mL；V樣總：樣品提取液總體積，1mL；Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/mL。

注意事項：

1. 試劑盒中試劑三、試劑四和標準品均需臨用前配制，且避光保存，配制好未使用完的4℃保存且3天內使用完畢。

2. 為保證實驗結果的準確性，需先取1-2個樣做預實驗，如果測定的吸光值過高（高于2.5），用蒸餾水稀釋后再測定。

3. 脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應在570nm處無吸收峰，因此，570nm處測定結果不含這兩種氨基酸的量。

4．最di檢出限為100μmol/L。